测序建库究竟是什么？

测序建库是现代基因组学和分子生物学研究中的一项基础性关键步骤,指的是将待测的DNA或RNA样本经过一系列处理，构建成适合高通量测序平台（如Illumina、PacBio、Nanopore等）识别和测序的文库，其核心目的是将原始的生物样本转化为测序仪能够“读懂”的格式，并通过引入特定接头序列（adapter）和条形码（barcode），实现对样本的标记、扩增和测序。

测序建库的基本流程

测序建库通常包括以下几个主要步骤：

样本提取与质量检测

首先需要从生物样本（如血液、组织、细胞等）中提取DNA或RNA，提取后的核酸需经过质量检测，包括浓度、纯度和完整性评估，使用琼脂糖凝胶电泳或Bioanalyzer等设备确认核酸是否降解，确保后续实验的可靠性。

核酸片段化

高通量测序平台对测序片段的长度有一定限制,因此需要将长链DNA或RNA打断成较短的片段，常用的片段化方法包括物理打断（如超声打断）和酶切法（如DNase I或转座酶处理），RNA样本通常需先反转录为cDNA，再进行片段化。

末端修复与加A尾

片段化的DNA末端往往不平整,需通过末端修复酶将其补平为平末端，随后，在3'端添加一个“A”碱基，以便与后续带有“T”尾的接头进行连接，这一步骤提高了接头的连接效率。

接头连接

接头是测序文库的重要组成部分,包含用于测序引物结合的序列、样本识别条形码（barcode）以及用于PCR扩增的引物结合位点，通过T4 DNA连接酶将接头连接到DNA片段的两端，形成完整的文库结构。

文库扩增与纯化

连接接头后的文库需要进行PCR扩增,以增加文库的产量，确保测序时有足够的模板，扩增后需通过磁珠纯化或凝胶电泳去除未连接的接头、引物二聚体等杂质，获得纯净的文库。

文库质检与定量

建库完成后,需对文库进行质检，包括片段大小分布（如Bioanalyzer检测）和浓度定量（如qPCR），质检合格的文库方可用于上机测序。

不同类型测序文库的构建

根据测序目的和样本类型的不同,测序文库可分为多种类型，常见的包括：

测序建库中的关键技术与挑战

接头设计

接头的序列设计直接影响文库的构建效率和测序数据的质量,合理的接头设计应避免形成二级结构，减少接头二聚体的产生，并确保条形码的唯一性，防止样本间交叉污染。

文库扩增偏差

PCR扩增过程中可能引入扩增偏差,导致某些片段被过度扩增，而其他片段扩增不足，为减少偏差，可采用高保真DNA聚合酶和优化PCR循环数。

样本污染与交叉污染

建库过程中需严格避免样本间的交叉污染,尤其是在处理多个样本时，使用独特的条形码和独立的实验操作区域可有效降低污染风险。

文库 normalization

在某些应用中（如多重测序），需对不同文库进行浓度 normalization，确保每个样本在测序中的数据量均衡。

测序建库的应用领域

测序建库广泛应用于生命科学研究的多个领域,包括但不限于：

• 疾病研究：通过全基因组或外显子测序寻找疾病相关基因突变。
• 癌症基因组学：分析肿瘤样本中的体细胞突变和结构变异。
• 微生物组研究：通过宏基因组测序分析环境或人体微生物群落。
• 农业育种：利用基因组测序辅助作物和家畜的遗传改良。
• 转录组学：研究基因在不同条件下的表达变化。

测序建库的未来发展趋势

随着测序技术的不断进步,测序建库也在向更高效、更自动化、更低成本的方向发展，单细胞测序建库技术的出现使得研究人员能够在单细胞水平上解析基因表达和基因组变异，基于微流控芯片的建库平台正在逐步实现建库过程的自动化和高通量化。

相关问答FAQs

Q1: 测序建库中的接头（adapter）有什么作用？
A1: 接头是测序文库中的关键组成部分，主要作用包括：1）提供测序引物结合位点，使测序仪能够识别并读取DNA片段；2）包含条形码（barcode），用于区分不同样本，实现多重测序；3）提供PCR扩增引物结合位点，便于文库扩增，合理的接头设计能有效提高测序效率和数据质量。

Q2: RNA测序建库与DNA测序建库的主要区别是什么？
A2: RNA测序建库与DNA测序建库的主要区别在于：1）RNA样本需先通过反转录酶转化为cDNA，再进行后续建库步骤；2）RNA建库过程中需考虑mRNA的富集（如poly-A选择）或核糖体RNA的去除；3）RNA文库可用于基因表达分析、可变剪接研究等，而DNA文库主要用于基因组变异检测、结构分析等。